Στη διάρκεια της πρώιμης βυζαντινής περιόδου, η Θεσσαλία αποτέλεσε διοικητικό τμήμα του Ανατολικού Ιλλυρικού (4ος - 6ος αι.) και στη συνέχεια του Θέματος της Ελλάδος. Είναι η εποχή της διάδοσης του χριστιανισμού, που ρίζωσε γρήγορα στην περιοχή του σημερινού νομού Τρικάλων, όπως μαρτυρεί η ύπαρξη επισκοπής Τρίκκης ήδη από τον 4ο αιώνα.

Από τη στιγμή που η νέα θρησκεία γίνεται επίσημη θρησκεία της αυτοκρατορίας ξεκινά και η ανέγερση χριστιανικών εκκλησιών, που την παρουσία τους μαρτυρούν στην περιοχή τόσο ο περίφημος παλαιοχριστιανικός Άμβωνας που μπορεί να δει κανείς ανασυγκροτημένο στην εκκλησία της Κοιμήσεως της Θεοτόκου στην Καλαμπάκα, όσο και τα ερείπια του παλαιοχριστιανικού ναού που βρέθηκε στο λόφο του Προφήτη Ηλία στα Τρίκαλα. Αυτά είναι από τα πρώτα μνημεία που μαρτυρούν την μετάβαση από την Ύστερη Αρχαιότητα στους Μέσους Χρόνους στην περιοχή.

Τα ονόματα των Γόμφων και της Τρίκκης, που αναφέρονται από τον Προκόπιο ανάμεσα στις πόλεις που επανοχύρωσε ο Ιουστινιανός στη διάρκεια του 6ου αιώνα, φτάνουν σε μας σαν απόηχος μιας άλλης εξέλιξης, όταν η ύπαιθρος ερημώνει και τα αστικά κέντρα παρακμάζουν, καθώς δέχονται τις διαδοχικές επιδρομές φύλων από το βορρά : Γότθων στα 396, Ούννων στα 447, Σλάβων στα 527 και, αργότερα, Σαρακηνών στα 976, Βουλγάρων στα 1025 και Νορμανδών στα 1081 μ.Χ.

Στο μεταξύ, από τον 10ο αιώνα, η πεδινή περιοχή του σημερινού νομού Τρικάλων έχει περιέλθει διοικητικά στο Θέμα της Θεσσαλονίκης ενώ η ορεινή περιοχή της Πίνδου στο Θέμα της Νικοπόλεως. Στην ίδια περίοδο κάνει την εμφάνισή του το όνομα των Βλάχων, λατινοφώνων της ορεινής Θεσσαλίας και ειδικότερα της Πίνδου, με κυρίαρχη από τότε παρουσία στην ιστορία της περιοχής, σε σημείο μάλιστα που τμήμα της να ονομάζεται Μεγάλη Βλαχία ήδη από τον 12ο αιώνα.

Από τον 10ο επίσης αιώνα - μέχρι σήμερα - υφίσταται η Μητρόπολη Σταγών, που έδρευε στην ομώνυμη πόλη, τη σημερινή Καλαμπάκα (Αιγίνιο της αρχαιότητας). Μάλιστα, ο ιστορικός Ιωάννης Βογιατζάκης υποστηρίζει πώς υπήρχαν δύο σταγοί, το Άστυ, στο σημερινό Καστράκι και το Εμπορείον στη σημερινή Καλαμπάκα. Για πρώτη πάντως φορά το όνομα Σταγοί το συναντούμε στη Διατύπωση του Λέοντος ΣΤ’' του Σοφού (9ος -10ος αι.) κι ακόμη γνωρίζουμε πως το φρούριο της πόλης είχε επισκεφθεί ο Βασίλειος Β' μετά το τέλος του Βουλγαρικού πολέμου (αρχές του 11ου αι.).

Το όνομα Σταγοί, κατά τον περιηγητή Πουκεβίλ, είναι παραφθορά της φράσης «στους Αγίους» (πιθανότατα εννοούνται οι βράχοι, λόγω των υπαρχουσών μονών) - στ’ Αγιούς - Σταγούς. Ο Ιωάννης Βογιατζίδης υποστηρίζει ότι η λέξη προέρχεται από τη λέξη σιταγωγός - σταγός (αλώνι) ενώ ο αρχαιολόγος - ιστορικός   Ι. Γιαννόπουλος, το αποδίδει στη σλάβικη λέξη στάγια (θάλαμος, κοίλωμα βράχου).

Το όνομα Καλαμπάκα, αρχίζει να χρησιμοποιείται από την εποχή του σουλτάνου Βαγιαζίτ Β’, μετά την τουρκική κατάκτηση της Θεσσαλίας (1393-1394) και προέρχεται κατ’ άλλους από τη λέξη Καλεμπάκ (ωραίο φρούριο) και κατ’ άλλους από το όνομα πιθανότατα κάποιου επώνυμου άρχοντα.

Επί αυτοκρατορίας Μανουήλ Κομνηνού η πόλη των Σταγών και η περιφέρειά της υπάγονται στο Θέμα των Σερβίων, που από τον 12ο αι. αποτελεί ξεχωριστό Θέμα.

Όταν στα 1204, οι Φράγκοι καταλαμβάνουν την Κων/πολη και επεκτείνονται σιγά - σιγά σ’ όλη την Ελλάδα, ο ν. Τρικάλων περνά στην κυριαρχία του Ελληνικού Δεσποτάτου της Ηπείρου του Μιχαήλ Αγγέλου Κομνηνού Δούκα, ο οποίος παραχώρησε στο νόθο γιο του, σεβαστοκράτορα Ιωάννη Άγγελο Κομνηνό Δούκα τον έλεγχο της Θεσσαλίας, που επονομάζετο τότε Μεγάλη Βλαχία.

Ο Ιωάννης ΄Άγγελος αναφέρεται σε χρονικό σημείωμα του 1788, το οποίο αναγράφεται στον κώδικα 793 της Ι. Μ. Αγ. Παντελεήμονος Αγ. Όρους, ως ο ιδρυτής της Ι. Μ. Μεγάλων Πυλών, στα βόρεια της Πύλης. 

Η Πύλη (παλιά Πόρτα) είναι κτισμένη ανάμεσα στον Ίταμο και τον Κόζιακα, στη βάση που ενώνει την Ήπειρο με τη Θεσσαλία και χωρίζεται με τον Πορταϊκό ποταμό από τον νέο οικισμό Πόρτα Παναγιά, όπου βρισκόταν η βυζαντινή πόλη «Μεγάλαι Πύλαι» ή Μεγάλη Πόρτα. Η ονομασία Πύλη μαρτυρεί πόσο σημαντική ήταν η τοποθεσία, ως είσοδος στην ΄Ήπειρο. 

Οι Καταλανοί αναστατώνουν και λεηλατούν άγρια την περιοχή των Τρικάλων στα 1309-1311, εποχή κατά την οποία την διοίκηση της περιοχής έχουν οι βυζαντινοί ευγενείς Στέφας και Μιχαήλ Γαβριηλόπουλος, με τίτλους όπως αυθέντης της Δ. Θεσσαλίας, Σεβαστοκράτωρ και Δεσπότης της Βορείου Θεσσαλίας, αλλά τυπικά η περιοχή υπάγεται στο Δεσποτάτο της Ηπείρου.

Η άγρια φορολογία και οι σκληρές συνθήκες που επέβαλαν στο λαό οι Γαβριηλόπουλοι, οδήγησαν στην απομάκρυνσή τους και στα 1333 η Δ. Θεσσαλία υπάγεται και πάλιν στη Βυζαντινή αυτοκρατορία με τον Ανδρόνικο Γ΄ Παλαιολόγο. 

Όμως, αυτή η ειρηνική περίοδος για την περιοχή θα είναι πολύ μικρή, γιατί ήδη μετά το 1318, την περιοχή των Τρικάλων, εποφθαλμιούν αρκετοί επιδρομείς, με κυριότερους τους Αλβανούς, ενώ και στο εσωτερικό οι πολλές εμφύλιες διαμάχες έμελλε να ανοίξουν τον δρόμο, στην κατάληψη της Θεσσαλίας από τους Σέρβους με ηγεμόνα τον Στέφανο Δουσάν. Αυτός ορίζει ως κυβερνήτη της περιοχής τον Γρηγόριο Πρελούμπιο, με έδρα τα Τρίκαλα, ο οποίος προηγουμένως εισέβαλε σ’ αυτήν και την κατέλαβε χωρίς αντίσταση.

Μετά τον θάνατο του Γρηγορίου Πρελούμπιου ο ετεροθαλής αδερφός του Στέφανου Δουσάν, Συμεών Ούρεσης αναλαμβάνει την συνέχιση της σέρβικης εξουσίας στη Θεσσαλία. Γύρω στα 1370, ο Συμεών Ούρεσης πεθαίνει και αφήνει στο θρόνο τον Ιωάννη Ούρεση, ο οποίος ήδη από το 1359-60 είχε αναγορευθεί σε συμβασιλέα, σε ηλικία μόλις 10 ετών. 

Ο Ιωάννης Ούρεσης Παλαιολόγος, που είναι ο τελευταίος απόγονος των Σέρβων ηγεμόνων, καταφεύγει μετά το 1372 και πριν τον Ιούνιο του 1373 στα Μετέωρα στη Μονή Μεταμορφώσεως, όπου γίνεται μοναχός με το όνομα Ιωάσαφ. 

Ως κοσμικός άρχοντας εκδίδει δύο «ορισμούς - προστάγματα», το Νοέμβριο του 1372 υπέρ του «πρώτου» της Σκήτης των Σταγών, Νείλου. Αντίγραφα αυτών, σώζονται σε ενιαίο φύλλο χαρτιού στη Μονή Μεταμορφώσεως και μάλιστα εκτίθενται στο μουσείο. Στο προσωπικό του εγκόλπιο - περγαμηνό - τετραβάγγελο που βρίσκεται στην Εθνική Βιβλιοθήκη Αθηνών, στο εσωτερικό της πρόσθιας πινακίδας της στάχωσης υπάρχει ιδιόγραφο το όνομά του. 

Την εποχή της σερβοκρατίας η περιοχή των Τρικάλων γνωρίζει μια μεγάλη πνευματική άνθηση και δραστηριότητα. Την σερβική κυριαρχία στην περιοχή θα διακόψει η έλευση των Τούρκων στα 1395.